Tầm quan trọng của tiền xử lý mẫu
Tiền xử lý mẫu là một bước tốn thời gian và dễ xảy ra sai sót trong phân tích thiết bị (đặc biệt là phân tích sắc ký). Chất lượng xử lý mẫu ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả cuối cùng của phân tích sắc ký. Vì vậy, để nâng cao hiệu quả phân tích và xác định, việc cải tiến và tối ưu hóa các phương pháp chuẩn bị mẫu và kỹ thuật phân tích sắc ký là một vấn đề quan trọng. Do một số mẫu thuộc hệ nền phức tạp, chứa các thành phần như protein, dầu, cacbohydrat, chất màu, v.v. nên nền nền nền phức tạp sẽ gây khó khăn lớn cho việc chiết, tách, tinh chế và xác định các hợp chất mục tiêu cần phân tích. Vì vậy, việc tiền xử lý mẫu không chỉ phức tạp, khó khăn mà còn có vai trò quyết định đến độ chính xác, độ tin cậy và độ nhạy của kết quả phân tích.
Tỷ lệ tiêu tốn thời gian tiền xử lý mẫu
Đối với các thiết bị có độ nhạy cao LC/MS/MS, việc xử lý trước mẫu thích hợp là rất quan trọng để giảm nhiễu nền và làm giàu các thành phần.
Nguyên tắc tiền xử lý mẫu
Tránh sự thay đổi hóa học của các thành phần trong quá trình chuẩn bị; ngăn ngừa và tránh ô nhiễm các thành phần đã xác định trước; giảm thiểu việc đưa các hợp chất không liên quan vào quá trình chuẩn bị; và làm cho nó đơn giản và dễ dàng nhất có thể.
Mục đích của tiền xử lý mẫu
Loại bỏ các hạt; giảm tạp chất gây nhiễu; tập trung các thành phần vi lượng; cải thiện độ nhạy và độ chọn lọc phát hiện; cải thiện hiệu quả tách; bảo vệ cột và dụng cụ sắc ký; thay thế dung môi.
Xu hướng phát triển của tiền xử lý mẫu
► Xử lý sơ bộ mẫu thông thường bao gồm: Phương pháp tiêu hóa: phương pháp đặt mẫu bằng axit, chất oxy hóa, chất xúc tác, v.v. vào thiết bị hồi lưu hoặc thiết bị kín, đun nóng và phân hủy và phá hủy chất hữu cơ. Phương pháp tiêu hóa ướt
1. Phương pháp phân hủy bằng axit nitric (đối với các mẫu dung dịch nước trong hơn) 2. Phương pháp phân hủy bằng axit nitric-perchloric (phân hủy các mẫu chứa chất hữu cơ khó oxy hóa) 3. Phương pháp phân hủy bằng axit nitric-axit sunfuric (axit nitric: axit sulfuric=5:2, thường thêm một lượng nhỏ hydro peroxide) 4. Phương pháp phân hủy axit sunfuric-axit photphoric (giúp loại bỏ sự can thiệp của ion Fe3+ trong quá trình xác định) 5. Phương pháp phân hủy axit sulfuric-kali permanganat (thường được sử dụng để xác định mẫu dung dịch thủy ngân) 6. Phương pháp phân hủy axit nitric-hydro peroxide: Một số người sử dụng phương pháp này để phân hủy các sản phẩm sinh học để xác định nitơ, phốt pho, kali, boron, asen , flo và các nguyên tố khác 7. Phương pháp phân hủy đa thành phần: Cần có hệ thống phân hủy axit hoặc chất oxy hóa từ ba thành phần trở lên. Phương pháp tro khô (phương pháp phân hủy ở nhiệt độ cao)
1. Phương pháp tro không sử dụng hoặc sử dụng một lượng nhỏ thuốc thử hóa học để phân hủy mẫu và có thể xử lý các mẫu có trọng lượng lớn hơn nên có lợi trong việc nâng cao độ chính xác của việc xác định nguyên tố vi lượng. 2. Nhiệt độ tro hóa thường là 450-550 độ, không thích hợp để xử lý các mẫu có thành phần dễ bay hơi và thời gian tro hóa cũng tương đối dài. 3. Tùy theo loại mẫu và đặc tính của các thành phần cần đo, các chén nung và nhiệt độ tro hóa khác nhau được chọn. Nồi nấu kim loại thường được sử dụng là thạch anh, bạch kim, bạc, niken, sắt, sứ, polytetrafluoroethylene và các tính chất khác. Nguyên tắc là nồi nấu kim loại không phản ứng với mẫu và ổn định ở nhiệt độ xử lý. 4. Thông thường, không có thuốc thử nào khác được thêm vào các mẫu sinh học tro hóa, nhưng để thúc đẩy quá trình phân hủy và ức chế sự mất bay hơi của một số nguyên tố, một lượng chất tro phụ trợ thích hợp thường được thêm vào. Sau khi mẫu được tro hóa hoàn toàn, mẫu được hòa tan trong axit nitric hoặc axit clohydric loãng để phân tích và xác định.
Conventional pretreatment methods Extraction and enrichment 1. Extraction method 1. Oscillation extraction method (vegetables, fruits, grains) 2. Tissue crushing extraction (extracting organic pollutants from animal and plant tissues) 3. Soxhlet extraction (commonly used to extract organic pollutants such as pesticides, petroleum, phenylhydrazine and pyrene from biological and soil samples) 2. Volatilization and evaporation concentration The volatile separation method uses the high volatility of certain components or converts the components to be measured into volatile substances, and then uses inert gas to take them out to achieve the purpose of separation. Evaporation concentration refers to heating the water sample on a hot plate or in a water bath to slowly evaporate the water, so as to reduce the volume of the water sample and concentrate the components to be measured. 3. Distillation method uses the different boiling points of the components of the water sample to separate them from each other; when determining volatile phenols, cyanides, and fluorides in water samples, they must first be pre-distilled and separated in an acidic medium; distillation has three functions: digestion, enrichment, and separation. 4. Ion exchange method uses ion exchangers to exchange reactions with ions in the solution for separation. Ion exchangers can be divided into inorganic ion exchangers and organic ion exchangers (ion exchange resins). ㈤ Coprecipitation method: The phenomenon that a poorly soluble compound in a solution carries out certain coexisting trace components in the process of forming a precipitate. The principle of coprecipitation is based on surface adsorption, the formation of mixed crystals, the interaction and inclusion of heteroelectron nuclei colloidal substances, etc. 1. Coprecipitation separation using adsorption: Common carriers include Fe (OH) 3, Al (OH) 3, Mn (OH) 2 and sulfides, etc. 2. Coprecipitation separation using the formation of mixed crystals 3. Coprecipitation separation using organic coprecipitants ㈥ Adsorption method: Use porous solid adsorbents to adsorb one or several components in the water sample on the surface to achieve the purpose of separation. Commonly used adsorbents include activated carbon, alumina, molecular sieves, large mesh resins, etc. The polluted components adsorbed and enriched on the surface of the adsorbent can be desorbed by organic solvents or heated for determination. ㈦ Chromatography Chromatography is divided into column chromatography, thin layer chromatography, paper chromatography, etc., and adsorbents are divided into inorganic adsorbents and organic adsorbents. ㈧ Sulfonation and saponification Sulfonation: The interfering substances such as fats and waxes in the extract can undergo sulfonation reaction with concentrated sulfuric acid to generate highly polar sulfonic acid compounds, which are separated from the pesticides in the extract as the sulfuric acid layer separates. The sulfonation method uses the saponification reaction of oils and fats with strong alkali to generate fatty acid salts and separate them. ㈨ Low-temperature freezing method is based on the principle that the solubility of different substances in the same solvent varies with temperature to separate them from each other. ㈩ Principle of extraction: The distribution coefficient of substances in different solvent phases is different, so as to achieve the separation and enrichment of components. Types of conventional liquid-liquid extraction Extraction of organic substances: Organic substances separated in the aqueous phase are easily extracted by organic solvents Extraction of inorganic substances: First, a reagent is added to combine with the ionic components in the aqueous phase to generate a substance that is uncharged and easily soluble in organic solvents. The reagent, organic phase, and aqueous phase together form an extraction system. According to the different types of extractables generated, it can be divided into chelate extraction system, ion-association complex extraction system, ternary complex extraction system, and synergistic extraction system. Overview of solid phase extraction (SPE) It is developed by combining liquid-solid extraction and column liquid chromatography technology. SPE is a column chromatography separation process, which has many similarities with high performance liquid chromatography (HLPC) in terms of separation mechanism, stationary phase and solvent selection. The particle size of SPE filler (>40μm) lớn hơn HLPC (3-10μm). Do đó, SPE chỉ có thể được sử dụng để tách các hợp chất có đặc tính lưu giữ rất khác nhau. Công nghệ SPE có hiệu suất tách thấp chủ yếu được sử dụng để xử lý mẫu. Mục đích của SPE là loại bỏ các chất cản trở quá trình phân tích tiếp theo khỏi mẫu; làm phong phú thêm các thành phần vi lượng và cải thiện độ nhạy phân tích; thay đổi dung môi mẫu cho phù hợp với phương pháp phân tích; tạo dẫn xuất tại chỗ; khử muối mẫu; và tạo điều kiện thuận lợi cho việc bảo quản và vận chuyển mẫu. Cột SPE cài đặt: Kích thước hạt phụ khác với cột phụ HLPC và phần còn lại giống nhau. Được sử dụng nhiều nhất là pha C18. Loại chất độn này có tính kỵ nước cao và có khả năng lưu giữ hầu hết các chất hữu cơ trong pha nước; các vật liệu khác có tính chọn lọc và lưu giữ khác nhau cũng được sử dụng. Các pha SPE có nhóm hoạt tính hoặc được phủ bằng hợp chất hoạt tính có thể được sử dụng để phân tích các phản ứng tạo dẫn xuất. Đĩa SPE: rất giống với màng lọc. Bộ chiết đĩa là một đĩa PTFE chứa chất độn hoặc tấm sợi thủy tinh được nạp chất độn; chất độn chiếm khoảng 60% đến 90% tổng số đĩa SPE và độ dày của đĩa khoảng 1mm. Sự khác biệt so với trước đây là tỷ lệ độ dày/đường kính (L/d). Thích hợp để làm giàu các chất ô nhiễm vi lượng từ nước. Chiết vi pha rắn (SPME) SPE ngoại tuyến và trực tuyến SPE ngoại tuyến 1. SPE và phân tích được thực hiện độc lập và SPE chỉ cung cấp các mẫu phù hợp cho phân tích tiếp theo. 2. Để đảm bảo đủ sự tiếp xúc giữa dung dịch mẫu và chất độn, dòng dung môi không được quá cao. 3. Nó có thể được hoàn thành bằng các công cụ tự động. Thiết bị SPE tự động bao gồm giá đỡ cột, bơm pít tông, bình chứa chất lỏng, đường ống và bộ xử lý mẫu. SPE trực tuyến còn được gọi là công nghệ làm giàu và tinh chế trực tuyến, chủ yếu được sử dụng để thiết lập phương pháp SPE phân tích HLPC Mục đích tiền xử lý cột: 1. Loại bỏ tạp chất có thể tồn tại trong chất độn; 2. Hòa tan chất độn và cải thiện khả năng tái lập của quá trình chiết pha rắn Thêm mẫu 1. Để tránh thất thoát chất phân tích, nồng độ dung môi mẫu không được quá cao; 2. Khi chiết bằng cơ học pha ngược, nước hoặc dung dịch đệm được sử dụng làm dung môi và lượng dung môi hữu cơ không vượt quá 10% (V/V); 3. Để khắc phục tình trạng thất thoát chất phân tích trong quá trình thêm mẫu, có thể dùng dung môi yếu để pha loãng mẫu, giảm thể tích mẫu, tăng lượng chất độn trong cột SPE và chọn chất hấp phụ có khả năng giữ chất phân tích mạnh. Rửa giải và thu chất phân tích (trường hợp khác là tạp chất được giữ lại trong khi chất phân tích đi qua cột) (Chiết pha rắn bằng môi trường phân tán rắn) 1. Đối với cột chiết pha đảo, dung môi làm sạch là nước hoặc dung dịch đệm chứa nồng độ hữu cơ thích hợp dung môi; 2. Để xác định nồng độ và thể tích tối ưu của dung môi làm sạch, hãy thêm mẫu vào cột SPE, làm sạch mẫu với thể tích gấp 5 đến 10 lần thể tích của giường cột SPE, lần lượt thu thập và phân tích nước thải và thu được cấu hình rửa giải dung môi làm sạch cho chất phân tích. Lần lượt tăng nồng độ của dung môi làm sạch và xác định nồng độ và thể tích thích hợp của dung môi làm sạch theo cấu hình rửa giải của chất phân tích ở các cường độ khác nhau; 3. Mục đích của quá trình rửa giải và thu gom: rửa giải hoàn toàn chất phân tích và thu lại ở phần thể tích nhỏ nhất, đồng thời giữ lại càng nhiều tạp chất bám chặt hơn chất phân tích trên cột SPE càng tốt; 4. Để tăng nồng độ của chất phân tích hoặc điều chỉnh các đặc tính của dung môi cho lần phân tích tiếp theo, phần chất phân tích thu được có thể được thổi khô bằng nitơ và sau đó hòa tan trong một thể tích nhỏ dung môi. Ứng dụng phân tích môi trường SPE 1. Nồng độ chất phân tích trong các mẫu môi trường như nước mặt rất thấp và chất phân tích phải được làm giàu trước khi phân tích. 2. Thành phần của chất lỏng sinh học rất phức tạp và chứa một lượng lớn protein. Trước khi phân tích, mẫu cần được xử lý trước để loại bỏ protein. Phân tích thuốc Phân tích lâm sàng Phân tích thực phẩm và đồ uống Chiết xuất vi pha rắn (SPME) Vi chiết pha rắn tích hợp "lấy mẫu, chiết, cô đặc và tiêm" và có thể được sử dụng kết hợp với sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao cho công nghệ tiền xử lý mẫu. Lý thuyết vi chiết pha rắn Lý thuyết cân bằng: Trong quá trình hấp phụ, trạng thái cân bằng hấp phụ được thiết lập giữa pha rắn và pha lỏng hoặc khí. Trong một khoảng thời gian nhất định, do quá trình chuyển khối chậm nên trạng thái cân bằng không đạt được hoàn toàn. Độ chọn lọc của việc chiết vật liệu phủ chủ yếu phụ thuộc vào hiệu suất của vật liệu phủ. Theo nguyên tắc chất phân tích dễ dàng được chiết bằng pha rắn có độ phân cực tương tự thì lớp phủ SPE phù hợp sẽ được chọn. Các chất được sử dụng phổ biến nhất cho lớp phủ pha rắn là polymethylsiloxane (PDMS) và polyacrylate (PA), cả hai đều có thể được sử dụng cho sắc ký khí và sắc ký lỏng. Loại thứ nhất chủ yếu được sử dụng cho các hợp chất không phân cực như hợp chất dễ bay hơi, hydrocacbon thơm đa vòng và hydrocacbon thơm, còn loại thứ hai chủ yếu được sử dụng cho các hợp chất phân cực như triazine và hợp chất phenolic. Lớp pha rắn có thể được phủ lên sợi thạch anh ở dạng không liên kết, liên kết hoặc liên kết ngang một phần. Việc thêm một số polyme vào lớp phủ có thể làm tăng diện tích bề mặt của lớp phủ và nâng cao hiệu quả của SPME. 1. Polydimethylsiloxane-divinylbenzen (PDMS-DVB), dùng cho hydrocacbon thơm và các hợp chất dễ bay hơi. 2. Polyethylene glycol-divinylbenzen (CW-DVB), dùng cho các hợp chất phân cực như rượu. 3. Nhựa khuôn mẫu Polyethylene glycol (CW-TPR), dùng cho chất hoạt động bề mặt bị ion hóa. 4. Sợi thạch anh phủ than chì đen, dùng để phân tích vết ô nhiễm trong nước và không khí. 5. Thiết lập phương pháp ống nano carbon và ống nano titan dioxide 1. Duy trì tính nhất quán của các điều kiện lấy mẫu. 2. Các yếu tố ảnh hưởng đến việc lấy mẫu bao gồm thời gian lấy mẫu, nhiệt độ, độ sâu của sợi, v.v. 3. Duy trì mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị phản hồi và nồng độ ban đầu của chất phân tích. Nồng độ mẫu không thể quá cao và thể tích mẫu không thể quá nhỏ, do đó quá trình chiết nằm trong phạm vi tuyến tính của đường đẳng nhiệt hấp phụ. 4. Thêm chất điện giải vào mẫu có thể làm tăng cường độ ion của dung dịch, do đó làm giảm độ hòa tan của chất phân tích và cải thiện hiệu suất chiết; Việc thay đổi độ pH của mẫu có ảnh hưởng lớn hơn đến tốc độ chiết các chất axit và kiềm. Lưu ý: Hiệu quả của việc thêm muối trong chiết xuất vi mô đôi khi khác với hiệu quả của chiết xuất lỏng-lỏng thông thường và các điều kiện thí nghiệm cần phải được tối ưu hóa. 5. Khuấy có thể rút ngắn thời gian chiết. Chiết bằng vi sóng (MAE) Chiết bằng vi sóng có thời gian chiết ngắn, độ chọn lọc tốt, tỷ lệ thu hồi cao, sử dụng ít thuốc thử, ít ô nhiễm, có thể sử dụng nước làm chất chiết và có thể tự động kiểm soát các điều kiện chuẩn bị mẫu; nó có ít ứng dụng hơn và hiện được sử dụng trong chiết xuất hydrocarbon thơm đa vòng, dư lượng thuốc trừ sâu, hợp chất hữu cơ kim loại, hoạt chất trong thực vật, chất độc hại, kim loại trong khoáng chất, thuốc trong máu và dư lượng thuốc trừ sâu trong các mẫu sinh học. Nguyên lý và đặc điểm của phương pháp chiết vi sóng Hấp thụ vi sóng (nước, etanol, axit, kiềm và muối) Hiệu suất chiết vi sóng cao: 1. Tác động trực tiếp của vi sóng lên các chất được tách ra; 2. Sử dụng dung môi phân cực sẽ có lợi hơn dung môi không phân cực để chiết bằng vi sóng; 3. Việc sử dụng hộp kín cho phép chiết bằng vi sóng được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiều so với nhiệt độ sôi của dung môi, nâng cao đáng kể hiệu quả chiết bằng vi sóng Phản xạ vi sóng (chất kim loại) Truyền vi sóng (chất không phân cực) Chiết bằng vi sóng thiết bị và phương pháp (các thành phần chính là thiết bị gia nhiệt vi sóng được sản xuất đặc biệt, thùng chiết và thiết bị kiểm soát áp suất, nhiệt độ được trang bị theo các yêu cầu khác nhau) Đa khoang 2450 MHz: Có thể chuẩn bị nhiều mẫu cùng một lúc, dễ dàng kiểm soát các điều kiện chiết , và việc khai thác là nhanh. Phương pháp chiết bằng vi sóng thông thường: Trộn các dung môi phân cực hoặc hỗn hợp dung môi phân cực và không phân cực với mẫu đã chiết, cho vào hộp chuẩn bị mẫu vi sóng và đun nóng trong hệ thống chuẩn bị mẫu vi sóng ở trạng thái kín. Kiểm soát áp suất chiết hoặc nhiệt độ và thời gian chiết theo yêu cầu của thành phần chiết; khi kết thúc quá trình gia nhiệt, lọc mẫu và đo trực tiếp dịch lọc hoặc đo sau khi xử lý tương ứng. Trong trường hợp bình thường, thời gian gia nhiệt chiết bằng vi sóng là khoảng 5 đến 10 phút. Tổng thể tích của dung môi chiết và mẫu không được vượt quá 1/3 thể tích của cốc chuẩn bị mẫu. Lấy nét đơn chế độ 2450 MHz: Không cần kiểm soát áp suất và nhiệt độ, khối lượng chuẩn bị mẫu lớn, mỗi lần chỉ có thể chuẩn bị một mẫu và thời gian chiết dài. Chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn (SCF)
Chất lỏng siêu tới hạn (SCF) là chất lỏng có nhiệt độ và áp suất cao hơn điểm tới hạn. Đặc điểm riêng của nó là: 1. Hệ số khuếch tán của nó nhỏ hơn hệ số khuếch tán của khí, nhưng cao hơn hệ số khuếch tán của chất lỏng một bậc; 2. Độ nhớt của nó gần bằng độ nhớt của khí; 3. Mật độ của nó tương tự như mật độ của chất lỏng, và một sự thay đổi nhỏ về áp suất có thể dẫn đến sự thay đổi đáng kể về mật độ của nó; 4. Những thay đổi về áp suất hoặc nhiệt độ có thể dẫn đến thay đổi pha. Nguyên tắc cơ bản Ở trạng thái siêu tới hạn, chất lỏng siêu tới hạn tiếp xúc với chất cần tách, để nó có thể lần lượt chiết xuất có chọn lọc các thành phần phân cực, điểm sôi và khối lượng phân tử tương đối, đồng thời mật độ và hằng số điện môi của chất lỏng siêu tới hạn tăng lên với sự gia tăng áp suất của hệ kín và độ phân cực tăng lên. Các thành phần có cực tính khác nhau có thể được trích xuất từng bước bằng cách sử dụng tính năng tăng cường chương trình. Độ hòa tan của CO2 siêu tới hạn: 1. Các thành phần ưa mỡ và có nhiệt độ sôi thấp có thể được chiết ở áp suất thấp (104kPa); 2. Hợp chất càng có nhiều nhóm phân cực thì càng khó chiết xuất; 3. Khối lượng phân tử tương đối của hợp chất càng cao thì càng khó chiết xuất. Chất biến tính CO2 là dung môi không phân cực và nói chung, dung môi phân cực được thêm vào để cải thiện khả năng hòa tan của nó trong CO2, vì vậy nó được gọi là chất biến tính. Những chất được sử dụng phổ biến hơn là metanol, axeton, etanol, etyl axetat, v.v. Tác dụng của chất biến tính còn hạn chế. Trong khi thay đổi độ hòa tan của chất lỏng siêu tới hạn, nó cũng sẽ làm suy yếu hiệu ứng thu giữ của hệ thống chiết, dẫn đến tăng lượng chất đồng chiết, có thể cản trở việc xác định phân tích. Lượng chất bổ trợ được sử dụng phải nhỏ, thường không quá 5%. Việc ứng dụng công nghệ chiết chất lỏng siêu tới hạn có ưu điểm rất lớn trong việc chiết xuất các chất tự nhiên; nó có thể được sử dụng kết hợp với GC, IR, MS, LC, v.v. để trở thành một phương pháp phân tích hiệu quả.
